RNA的提取方法步骤及原理.

1. RNA的提取方法步骤及原理.

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。

水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

扩展资料与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。
RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。
在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。
参考资料来源：百度百科-RNA

2. RNA的提取方法

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb
2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。
3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。
4、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）
5、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
6、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。
7、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。

扩展资料：
DNA提取原则：
1、保证核酸一级结构的完整性；
2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；
3、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；
4、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
参考资料来源：百度百科——DNA提取

3. 提取的RNA组织研磨时,是否需要在超净台内操作

当然需要，RNA在室外很容易被RNA酶水解而且RNA酶很难清除，因此必须在超净台内操作。
至于研磨只要小心一点就行，要不换个大的研钵也行。

4. 哪种生物安全柜适合我用，我是做PCR实验的

这个是根据定量PCR算法决定的，如果是相对定量，就需要内参，内参主要是使样品均一化，你做实验的时候，可能提取RNA时所用的样品是相同的，反转录时所用的mRNA的量是相同的，做定量PCR时所加的cDNA量也是相同的。但是你的样品是新长的部分，还是老的部分？
换海尔新出的那种“智净”系列的安全柜吧，海尔独有的一个“恒风速”专利，是全生命周期都能保障安全柜风速恒定的，一步解决所有安全柜久用过滤器堵塞，风速降低或不均匀这些问题，一劳永逸的。海尔设备不用说了，国产最靠谱的了，现在刚好是新款

5. RNA提取原理

6. 提取RNA需要在冰上操作吗

是的，RNA很容易降解，尤其在水溶液中，提取时尽量在低温进行。

7. SDS-LiCl提取植物RNA离心完没RNA沉淀是怎么回事？该怎么办？

最大的可能性就是在提取过程中被酶消化掉了，RNase在空气中，认得唾液中都有存在都会使RNA降解，推荐在生物安全柜中操作或者在超净台中。实在不行就买试剂盒吧，我们都用试剂盒提取的，效果还不错

8. 高中生物。RT-PCR怎样检测病毒含量呢？

RT-PCR检测方法的具体步骤如下：
（一）RNA提取 
  1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。 
  2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。   3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。 
  4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。 
  5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。 
  6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。 
  7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。 
  8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。 
  9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。 
  10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。 
  注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。 
（二）反应体系配制   
 1、实验设计：   检测标本RNA  
  阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）   阳性对照：已知病毒RNA 
  
 2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）   1）按下表加入试剂：   PCR反应体系 
对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下： 
  （1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；   
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。   
2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。  
3）加RNA模板（在核酸提取区） 
  将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反应 
  将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR   扩增。
4、RT-PCR产物检测 
  1）2.0％琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。 
  2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。 
  3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。   4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。   5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。
5、结果判断。